血細胞計數(shù)原理

細胞培養(yǎng)技術(shù)中，細胞計數(shù)是一項基本功，對于標準化培養(yǎng)條件以及需要定量的實驗來說都關(guān)鍵。這里介紹使用血細胞計數(shù)器對細胞進行計數(shù)的經(jīng)典方法以及中間一些需要注意的細節(jié)。
制備細胞懸液：
對于貼壁生長的細胞，我們需要使用胰酶消化的方法使細胞從培養(yǎng)皿表面脫落
根據(jù)需要加入合適體積的培養(yǎng)基，將細胞進行中和及稀釋，以得到均質(zhì)的細胞懸液。要求盡可能將細胞吹打散開，不要殘留任何細胞團
準備血細胞計數(shù)器：
使用70%乙醇將蓋玻片和血細胞計數(shù)器清潔干凈
將將蓋玻片潤濕（使用水或呼一口氣，目的是使蓋玻片與血細胞計數(shù)器接觸更緊密，易于粘連），并覆蓋至血細胞計數(shù)器上
臺盼蘭染色（可選）：
如果需要計算細胞的活力，則需要將細胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合
室溫孵育3-5分鐘，使臺盼蘭進入死細胞，使死細胞著藍色
血細胞計數(shù)器加樣：
使用吸管將細胞懸液或細胞/臺盼蘭混合液滴加到血細胞計數(shù)器計數(shù)池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數(shù)池
以同樣的方式在另一側(cè)的計數(shù)池中也加入細胞懸液
將計數(shù)板放置幾分鐘使細胞擴散，同時用吸水紙吸除多余的液體
細胞計數(shù)：
在100倍顯微鏡下，移動計數(shù)板將視野對準計數(shù)板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個視野
使用手持式計數(shù)器記錄計數(shù)池四個角以及中央方塊內(nèi)的細胞數(shù)（1-5號位置，經(jīng)典的current-protocol推薦每個方塊細胞數(shù)應(yīng)不大于20-50），并重復(fù)記錄另一側(cè)計數(shù)池中的細胞數(shù)，總計十個方塊。計數(shù)的方法是只計算上邊和左邊壓線的細胞，而右邊和下邊壓線的細胞不予計算（下圖，總體原則是“計上不計下，計左不計右"，判斷標準為是否接觸三條邊線的中間線）。如果有多個細胞沒有吹散成團存在，此時只可記為一個細胞。如果團塊很多，則可能需要重新吹打甚至消化直至絕大多數(shù)細胞為單個細胞